一、疾病概述

手足口病( hand, foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名，在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行，当年累计病例489540例，死亡127例；其后发病病例呈逐年上升趋势， 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面，手足口病高发于5岁以下婴幼儿，其中以1~3岁发病率最高，各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性，人口密度越大发病率越高。在时间方面，手足口病爆发存在明显季节性特征，尽管全年均有手足口病感染情况，但主要高发于夏季， 4~6月为发病高峰。在地区方面，中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰；而在北方仅有六月一个发病高峰，随着纬度的增加，其半年周期性可能会增强。与此同时，气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日，手足口病已被我国列为丙类传染病，该病流行已成为严重的公共卫生问题，为我国带来了巨大的经济和健康负担。

引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属（Enterovirus genus），基本结构为无包膜的二十面体，其直径为20-30nm，由核酸和蛋白质组成，是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框，开放阅读框编码多聚蛋白;其中VP1基因序列具有高度多样性，且较为稳定，因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。

由于CA16病毒主要通过粪口传播，在自然感染状态下经胃肠道侵入机体，因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA16小鼠腹腔注射感染模型的基础上，继续研究了通过灌胃方式建立的小鼠感染模型，为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础，也可用于药物和疫苗开发和验证实验。

二、研究背景

1、CA16病毒信息

CA16病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，是柯萨奇病毒A组成员，病毒呈对称二十面球体结构，无囊膜，直径24～30nm，由蛋白外壳和核酸组成。CA16病毒基因组为单股正链RNA，全长约7.4 kb。CA16基因组顺序依次为5'端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3'端非编码区。5'端非编码区的RNA主体结构呈RE型折叠结构的三叶草分子结构，以共价键结合毒粒蛋白（VPg），与病毒RNA的合成与装配有关。3'-非编码区末端的长度约为98~101个碱基，含有一个约50 nt的多聚腺苷酸尾（polyA尾），其长度可变，与病毒感染特异性有关。基因组的P1 区编码4 种衣壳蛋白VP1 ~VP4，VP1 ~ VP3 在病毒表面，VP4 包裹在感染病毒的内部，均具有抗原活性；P2 和P3 区编码7 种非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D，与病毒RNA 的复制、转录，病毒多聚蛋白的剪切、病毒颗粒的装配等功能相关。

根据VP1基因序列的差异性将CA16分为2个不同的基因亚型：A和B，流行株以B基因亚型为主，可进一步分为B1和B2。目前CA16流行株主要为B1基因型，其中以B1a和B1b基因亚型为主。CA16流行无明显的地区性。一年四季均可发病，以夏秋季多见，冬季的发病较为少见。病毒主要经粪-口和/或呼吸道飞沫传播，亦可经接触病人皮肤、粘膜泡疹液而感染。

CA16病毒可在RD细胞中培养，培养温度为 37℃，48~96h达到复制高峰，病毒滴度可达107TICD50以上；病毒在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变（CPE），表现为细胞皱缩、变圆脱落，最后病毒颗粒破膜释放。CA16病毒的感染可以诱导机体产生高滴度的抗体，具有中和作用，能够抵抗病毒的再次感染。

2、实验动物背景信息

ICR小鼠毛色白化，是国际通用的封闭群小鼠，适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好。雌鼠自发性畸胎瘤和管状腺瘤发病率为0%~1%，用氨基甲酸乙酯诱发时，11~16天胚胎期畸胎瘤和管状腺瘤发病率为5.9%，离乳个体管状腺瘤和囊瘤发生率为30%，孕鼠为3%。具有稳定的外周血项和骨髓细胞，是良好的血液学实验用动物。10日龄以内的ICR乳鼠对手足口病原较为敏感，乳鼠感染后常表现出衰弱、体重下降、后肢瘫痪、甚至死亡的症状，属于部分疾病动物模型，是进行手足口病研究较为理想的动物模型。

3、研究背景

CA16是手足口病的主要致病病原之一,与肠道病毒EV71经常交替或同时在中国大陆地区传播，引发严峻的公共卫生问题。随着EV71疫苗的面世，EV71的流行已得到一定的控制，而 CA16 的传播仍是手足口防控的重点，研究其感染、致病机制和开发特异性疫苗、药物是重中之重。

颅内注射感染和腹腔注射途径的感染与CA16病毒粪口传播的自然感染方式存在一定的差距，因此有必要建立稳定的CA16病毒灌胃感染动物模型，不仅可以用于研究病毒自然感染机制和机体免疫反应，也补充了药物和疫苗研发和验证的关键模型。

已报道的CA16病毒动物感染模型主要以腹腔注射和颅内注射为感染途径，采用1-7日龄的ICR乳鼠为感染动物。中国CDC建立的模型采用了1日龄ICR小鼠，通过颅内注射的途径感染3.0X102PFU（260LD50）的BJCA08/CA16毒株（A Neonatal Mouse Model of Coxsackievirus A16 for Vaccine Evaluation. Journal of Virology, 2012, 86(22): 11967–11976）。中科院上海生命科学研究所采用1日龄ICR乳鼠感染CA16/SZ05CA16毒株，感染剂量为2X106 TCID50，感染途径为腹腔注射（A murine model of coxsackievirus A16 infection for anti-viral evaluation.Antiviral Research,2014, 105: 6–31.）。

本课题组已建立的CA16动物感染模型采用腹腔注射途径，对7日龄ICR乳鼠感染2.5X107TCID50CA16shzh05-1病毒。动物自感染后第3天（3dpi）开始出现症状，表现为弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。4dpi动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状，5dpi动物开始出现死亡，在10天内全部死亡。同时，相对于正常组小鼠，感染小鼠体重增加减缓。感染后最初在外周血中检测到CA16病毒，随后逐渐下降。各组织中病毒载量在3dpi和5dpi达到高峰，其中骨骼肌内病毒载量最高，在3dpi可达到108copies/mg组织，脑中病毒载量在5dpi达到高峰，可达106copies/mg组织，表明了病毒感染引发病毒血症后，病毒经血液向组织扩散，并在组织内复制。脑内病毒的高峰期滞后于骨骼肌，表明病毒经肌肉内神经元逆向轴突传递至脑内，而非病毒经血液直接扩散至脑部。病理检测可观察到后肢骨骼肌、心脏、肝脏、脾脏、大脑都发生了病毒感染相关的病理变化。

1.病毒准备：CA16病毒(shzh05-1，GenBank: EU262658)，2008年分离自深圳市，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。

（1）细胞病毒培养操作：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA16病毒后，置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TCID50。

（2）组织病毒培养操作：

将CA16病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.实验动物：采用SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。CA16动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。

3.病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为1. 0×108 TCID50/mL的CA16毒株，将病毒经灌胃途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。

1.临床症状表型：

7日龄ICR小鼠灌胃感染CA16病毒5天后，开始出现不同程度的临床症状，症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。临床症状评分持续升高，8dpi感染小鼠出现死亡。到观察期结束（12dpi）时平均临床评分为3分，存活率为60%（图1A，1B）。监测体重情况，发现感染小鼠体重增加未出现显著减缓，与未感染的对照小鼠不存在显著性差异（图1C）。

图1.ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后症状观察。A，感染后乳鼠的存活率时间变化曲线； B，感染后乳鼠的临床症状评分时间变化曲线； C，感染后乳鼠体重随时间变化曲线。

2.血液和组织中病毒复制情况：

分析灌胃途径感染CA16的小鼠血液与组织中病毒载量发现，5dpi血液中病毒载量病毒载量高于3dpi（图2A），103~105Copies/mg。小鼠中肌肉病毒载量变化与腹腔注射途径感染小鼠趋势相同，病毒载量在5dpi均有提升：由均值106Copies/mg提升至均值107Copies/mg（图2B）。在其它组织中，CA16病毒载量明显偏低，未有组织病毒载量超过104Copies/mg（图2C）。

图2.ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后血液和组织中病毒载量情况。A，感染后第3天和第5天血液中病毒载量情况； B，感染后第3天和第5天后肢肌肉组织中病毒载量情况；C，感染后第5天心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺和脑组织中病毒载量情况。

3. 病理变化情况：

CA16病毒具有明显的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒载量最高，且感染后的临床症状也表现为后肢的瘫痪症状，病理结果分析发现：骨骼肌病理损伤严重，具体表现为骨骼肌细胞变性坏死、炎细胞浸润（图3A）。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象。其他组织，包括脾、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾、小肠组织均未见明显病理损伤。

综上可见，通过灌胃感染途径成功建立了CA16病毒感染小鼠模型，相较于腹腔感染途径其症状相对较轻，可以作为腹腔感染重症模型的补充，用于评价疫苗和药物。

模型评价方法：

1. 临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染CA16病毒后观察12天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分：

0：未见异常；1：驼背或炸毛；2：后肢迟缓无力；3：单后肢瘫痪；4：双后肢瘫痪；5：死亡。

2. CA16病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

2.1取样：分别在感染后第3天、第5天处死动物，采集血液100ul和后肢肌肉组织样本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和组织中的RNA；

2.3 反转录：Thermo fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit；根据说明书采用Radom Hexamer Primer，反应条件为：25℃ 5min；42℃ 60min，70℃ 5min；

2.4 SYBR Green染料法-荧光定量PCR检测病毒核酸浓度：

（1）特异性引物：

CA16-F1 （5’-TAGGGACGCACGTGATCTGGGACTTCG-3’）

CA16-R1（5’-GCACCAATGGGAACTACATAGTTAGTTTG-3’）

（2）标准品：建立质粒标准品，使用分光光度计检测质粒浓度，适当稀释使质粒浓度拷贝数为109，10倍稀释为8个梯度，每个浓度做3个重复，依据拷贝数与Ct值建立标准曲线。

（3）阴性对照和阳性对照：阴性对照用水代替核酸样本；阳性对照采用CA16病毒储液提取得到的核酸；

（4）荧光定量PCR试剂：Takara，SYBR Green Premix(with ROX)，根据试剂盒要求准备反应体系；

（5）反应条件： 94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，该步骤循环数为40；熔解曲线：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

（6）实验仪器：ABI Q3荧光定量PCR仪

（7）结果分析：①反应结果应符合阴性对照无扩增的条件，否则实验结果无效。②标准曲线：标准曲线R2大于0.95可用，若低于0.95数据不可用，则需重新测定；③结果判断：根据标准曲线计算出CA16病毒的载量。病毒载量的检测阈值为2X102copies/μl，低于该数值的结果不可信。

3.病理分析：HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

ICR小鼠灌胃感染CA16病毒5天后，取后肢骨骼肌、心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑置于10%福尔马林中固定72 h，经梯度酒精脱水后将其包埋在石蜡中，切片得到的石蜡切片厚度为 5 μm，随后进行H&E染色，最后在光学显微镜下观察组织病理变化。

（二）评价指标：

1.临床症状评价：根据临床评分标准，在灌胃感染CA16病毒观察期（12天）内，5dpi可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；8dpi出现死亡，在观察期结束时存活率为60%。

2. 血液和组织中病毒复制情况评价体系：经灌胃感染CA16病毒后，病毒在动物血液和肌肉中复制水平持续增高，在血液中检测值从均值104 copies/μl升高到均值105copies/μl，在肌肉中从均值106copies/mg上升到107 copies/mg，说明病毒在血液和肌肉中都发生了扩增，尤其是肌肉中病毒载量明显高于血液，体现出典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上，但低于104 copies/mg。

3. 病理评价体系：CA16病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润。与后肢肌肉中的病毒载量最高、后肢瘫痪的临床症状相一致。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象，说明在小鼠CA16灌胃感染模型中也能出现神经性病变。

CA16病毒在人间传染病名录中属于第三类，涉及的实验需在BSL-2实验室进行，动物实验在ABSL-2实验室开展。CA16病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。

CA16病毒对5岁以下儿童易感，主要通过粪口传播，对于具有BSL-2防护装备的实验人员危害较小；实验人员均经过生物安全培训获得证书；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套，防护眼镜等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。

成年ICR小鼠对CA16病毒不敏感，21日龄ICR小鼠在感染大剂量病毒后仍能自愈。对于感染动物的排泄物进行检测，在少数粪便样本中检测到少量病毒，载量约为2X102~103copies/mg；因此需对垫料等接触动物粪便的物品按要求进行高压灭菌处理。

动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

采用7日龄ICR乳鼠、经灌胃CA16病毒的感染途径，成功获得CA16病毒灌胃感染小鼠模型。模型建立过程中采用临床评分标准对感染后动物的临床症状进行评价，并记录死亡率和体重情况；采用荧光定量PCR-标准曲线法对感染后动物血液和组织中的病毒载量进行测定，以确定病毒的复制情况；采用HE染色法对组织切片进行病理观察，确定组织病变情况。

本CA16病毒灌胃感染小鼠模型与文献报道两种CA16小鼠模型（CDC模型和中科院上海所模型）相比，都采用国际通用的封闭群ICR小鼠的乳鼠作为感染对象，都成功得到了CA16感染小鼠感染模型。感染后动物均出现明显的临床症状，包括驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，并都观察到了动物死亡；临床评分在观察期内不断升高。通过监测感染小鼠的血液和后肢肌肉组织样本中的病毒载量，发现均呈现上升趋势，说明病毒在机体内的大量复制扩增；尤其是在肌肉组织中病毒载量的结果与临床症状相吻合。采集感染小鼠第5天心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，检测病毒载量在检测阈值之上，说明除了肌肉组织CA16病毒也能在其他组织中进行复制，并脑组织中观察到了相应病变。

本模型与文献模型的不同之处在于：与CDC模型采用的病毒株不同，来自于不同病人的临床分离株；小鼠的日龄不同，我们使用7日龄的ICR乳鼠，相对于其他两种模型采用1日龄小鼠更易于操作；感染途径不同，我们采用灌胃感染的方式，而非采用颅内注射（CDC模型）或腹腔注射（中科院上海所模型）感染方式，更接近于病毒粪口传播的自然感染途径，有利于观察和研究CA16病毒的自然感染机制、嗜肌性以及对其他组织的损伤。同时，由于感染途径的不同，导致本模型感染动物临床症状相对较轻，可以作为重症模型的补充，用于疫苗评价和药物筛选。

由于CA16病毒主要通过粪口途径传播，在自然感染状态下是经胃肠道侵入机体的，因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA16小鼠腹腔注射感染模型的基础上，通过灌胃方式建立的小鼠感染模型，为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础，也完善了应用于药物和疫苗开发实验的模型种类。